[目的]：

研究 Ca2＋-calpain/p35 -CDK5/p25 途徑在 BDE-153 神經毒性中的作用，為探尋BDE-153 神經發育毒性的機制提供研究線索。

[方法]：

體內實驗方法：將出生 10 天的雄性仔鼠按窩別和體重隨機分成 4 組，分別設為橄欖油溶劑對照、1mg/kg，5 mg/kg 和 10 mg/kg BDE-153 組，每組 10 只。按 10 ml/kg 一次性腹腔注射染毒。在染毒后 1 月齡和 2 月齡時，用 Morris 水迷宮，跳臺實驗、避暗實驗檢測大鼠的神經行為功能，用曠場實驗檢測大鼠的自發活動能力。染毒 2 月后，用 HE 染色檢測大鼠腦組織神經細胞的損傷，并在電鏡下觀察神經細胞超微結構的改變。用 TUNEL 染色法和流式細胞儀檢測大鼠神經細胞凋亡率和 Ca2+濃度，用乳酸脫氫酶檢測試劑盒檢測LDH 漏出率。Real time QPCR 和 Western Bolt 技術檢測 calpain、CDK5 以及 p25 和 p35基因和蛋白表達的改變，ELISA 試劑盒檢測 calpain、CDK5/p25 和 CDK5/p35 激酶的活力。體外實驗方法：原代培養的處于對數生長期大鼠神經元，經神經元純度鑒定后，隨機分為空白組，DMSO（溶劑）組， 10μmol/L BDE-153, 20μmol/L BDE-153， 40μmol/LBDE-153，染毒 48h后，顯微鏡下觀察原代神經細染毒后的形態學改變，CCK-8 法檢測細胞的活力，用 LDH 檢測試劑盒檢測 LDH 漏出率。Hochest33258 染色，AO/EB 雙熒光染色以及流式細胞儀等方法觀察和檢測神經細胞的凋亡情況、細胞內 Ca2+濃度；Realtime QPCR 技術、免疫熒光技術檢測 calpain、CDK5 以及 p35 基因和蛋白表達的改變，并用 ELISA試劑盒檢測 calpain、CDK5/p25 和 CDK5/p35 激酶活力。另外，采用 PD150606抑制 calpain 后，CCK-8 法檢測神經細胞活力，ELISA試劑盒檢測 calpain，CDK5/p25 和CDK5/p35 激酶活力的改變。

[主要試劑和儀器]

CCK-8 （Cell Counting Kit-8）,dojindo 株式會社

ELISA檢測試劑盒，上海江萊生物

酶標分析儀，BIO-RAD680 型，美國 Bio Rad 公司

caplain 抑制劑 PD150606：5mg 的 PD150606 離心后用 2.72ml DMSO 充分溶解，則配成 濃 度 為 6mmol/L 的 貯 備 液 ， 取 0.73μl 稀 釋 成 5mmol/L, 逐 步 配 制 成 4mmol/L,2.5mmol/L,2mmol/L,1mmol/L,0.5mmol/L 的使用液。

江萊生物產品文獻：Ca_2_calpain_p35_省略_DE_153神經毒性中的作用研究