主要試劑
1、標本和細胞培養液:同形態學檢測法。
2、3H-TbR:比放射性5.5-7.4×10】12Bq/mmol,用時每管加20μl即可,最終濃度為3.7×10】4Bq/ml。
3、閃爍液:取4.0g 2,5-二苯基惡唑(PPO)、0.4g 1,4雙(5-苯基惡唑基-2)苯(POPOP)加入1000ml二甲苯中。
4、其他試劑:50.0g/L三氯醋酸、無水乙醇。
操作步驟
1、按形態學方法進行血培養,孵育至72h收獲,如用特異抗原代替PHA,則孵育至120h收獲。在收獲前8h加入3H-TdR。
2、培養完畢,輕輕吸出培養液,在沉淀細胞懸液中加入6ml蒸餾水,低滲破壞紅細胞,加入35.0g/L NaCl 2ml調回等滲狀態。
3、離心1000rpm 10min,棄上清液。每管加2ml生理鹽水后,滴入裝在抽濾裝置上的49型玻璃纖維濾片中央,用10ml生理鹽水沖洗樣品管,使其在全部滴在濾片上。
4、滴加50.0g/L三氯醋酸2-3ml,固定樣品,再滴加無水乙醇1-2ml脫色和脫水。如果測定標本多,最好用多道細胞收集器進行收獲,第2-4步可一次完成。
5、取下濾片,置80℃烘箱30min烘干。
6、將烘干的濾片放入盛有5ml閃爍液的小瓶中,使滴加樣品的一面朝上,用液體閃爍儀測其cpm值。
注意事項
1、培養瓶的玻璃質量可影響轉化率,故選用中性玻璃的小瓶(可用鏈霉素或胰島素瓶代替)或試管。培養瓶應有足夠的空間,一般用10ml試管加入2ml培養基較好。
2、放射性核素摻入法的影響因素較多,如細胞數、PHA濃度、培養時間、培養液成分3H-TdP的活性等,故應嚴格控制實驗條件。